近日，約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Carol W. Greider團隊在Science發(fā)表了題為“Human telomere length is chromosome end–specific and conserved across individuals”的文章，介紹了一種基于納米孔測序技術(shù)的端粒分析方法——Telomere Profiling，可以單核苷酸分辨率測量細胞中每個端粒的長度。Carol W. Greider曾與Elizabeth Blackburn、Jack Szostak以”發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護染色體的“這一研究成果，獲得2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
研究團隊利用這一新方法對 147 個個體的染色體端粒長度進行分析，發(fā)現(xiàn)端粒中位長度為 4.7kb，但不同染色體端粒長度差異極大，平均值相差超6kb。特別地，這種染色體末端特異性端粒長度差異具有個體保守性，在出生時就已確定，隨年齡增長也得以保持。這一發(fā)現(xiàn)對于理解端粒生物學(xué)、衰老過程以及相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要意義。綜上，Telomere Profiling方法易于實施、結(jié)果精確并且成本較低，可廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床診斷，將使探索端粒生物學(xué)的全新領(lǐng)域成為可能。
文章發(fā)表在Science
主要研究內(nèi)容:
1.納米孔端粒分析準確且可重復(fù)報告端粒長度
為確定人類端粒是否在所有染色體上保持共同的長度分布，或者特定的染色體末端是否保持自己獨特的長度分布，研究團隊開發(fā)了一種富集、分析端粒的方法Telomere Profiling：首先使用生物素化的寡核苷酸（TeloTag）標記端粒末端；隨后用鏈霉親和素分離標記的端粒，并通過限制性內(nèi)切酶酶切將其釋放；最后通過牛津納米孔技術(shù)（ONT）長讀長測序方法對端粒進行測序。據(jù)悉，使用該方法檢測每個樣本的成本約為75美元。此外，研究團隊還開發(fā)了新生物信息學(xué)分析流程來確定染色體末端特異性端粒長度。
接下來，研究團隊通過對0歲至90歲人群的外周血單核細胞（PBMC）進行了端粒分析，并將其與Southern印跡法、FlowFISH檢測的結(jié)果進行對比。結(jié)果顯示，經(jīng)不同方法所檢測的端粒長度高度一致，表明Telomere Profiling方法具有高度準確性及優(yōu)異可重復(fù)性。此外，研究團隊還通過檢測7個樣本的端粒長度來檢測實驗室間的差異性，確認了該方法的廣泛適用性和可靠性。
圖1. 納米孔技術(shù)進行端粒分析是準確和精確的
2.端粒長度隨年齡增長而發(fā)生變化
已知端粒長度隨著年齡的增長而縮短，但先前方法無法在核苷酸分辨率上測量端粒長度。為檢測端粒長度動態(tài)范圍，研究團隊使用Telomere Profiling對11個個體（0-84歲）的DNA樣本進行分析，并根據(jù)端粒長度進行排序；通過Southern印跡法對相同的DNA進行測量，并將其作為驗證。結(jié)果顯示，Telomere Profiling預(yù)測了端粒長度的等級順序，捕獲了Southern印跡的動態(tài)范圍，并測量端粒隨年齡增長而縮短的情況，這對于理解衰老過程中的生物學(xué)變化至關(guān)重要。此外，Telomere Profiling還確定了端粒長度的第1、第10和第50百分位數(shù)。
研究團隊還將該方法與FlowFISH進行了比較，使用先前診斷為短端粒綜合征的特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者的5μg存檔DNA樣本進行分析。結(jié)果顯示，大多數(shù)IPF樣本的整體端粒長度與FlowFISH測量結(jié)果相似，表明Telomere Profiling能夠檢測出患病個體，有望助力臨床診斷和治療。
圖2. 納米孔端粒分析檢測端粒長度隨年齡的動態(tài)變化
3.人類端粒具有染色體末端特異性長度和單倍型特異性長度差異
為確定人類是否具有染色體末端特異性端粒長度，研究團隊分析了來自二倍體HG002細胞系的端粒，從HG002細胞系中分離DNA，并對端粒進行測序，將平均總長度為16.4 kb的reads映射到HG002參考基因組中，共有77個染色體末端通過質(zhì)量篩選。結(jié)果顯示，每條染色體的末端表現(xiàn)出不同的端粒長度分布；端粒中位長度為 4.7kb，有66個端粒的長度分布與均值有顯著差異，平均長度差異超過6kb。除染色體末端特異性長度外，一些端粒在母系和父系單倍型之間也存在顯著差異。上述結(jié)果表明，人類端粒具有染色體末端特異性長度分布。
圖3. 染色體末端特異性端粒長度
4.染色體特異性端粒長度在個體間是保守的
研究團隊將150個個體的端粒序列與最近發(fā)布的泛基因組中的亞端粒序列進行了比對，將300個單倍體基因組的全基因組序列與3個高質(zhì)量單倍體參考T2T基因組CHM13、HG002母基因組和HG002父基因組的序列進行比對，以確定每個參考基因組中相同亞端粒的可重復(fù)性。在所有reads中，87%在泛基因組和CHM13中定位到相同的染色體末端，90%在泛基因組和HG002母系中定位到相同的染色體末端，88%在泛基因組和HG002父系中定位到相同的染色體末端。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)Telomere Profiling檢測的reads均可映射到一個特定的泛基因組染色體圖譜，具有很高的可信度。
研究團隊建立了相對平均端粒長度，分析了147個個體PBMC樣本每個染色體末端端粒長度，并根據(jù)端粒的相對長度對染色體末端進行排序。結(jié)果顯示，17p、20q和12p往往是群體中最短的端粒，而4q、12q和3p往往是最長的端粒。因此，雖然在單個個體中可以看到端粒長度的單倍型特異性差異，但在整個群體中，某些染色體末端更有可能比總體平均值短，而其他染色體末端更有可能比總體平均值長。研究團隊還分析了不同年齡段的樣本，在嬰兒臍帶血樣本發(fā)現(xiàn)了同樣的端粒長度差異，說明隨著年齡增長，端粒長度普遍縮短，但長度差異保持不變。這些結(jié)果表明，個體端粒長度的差異是在出生時就已存在，且在不同個體間是保守的。
圖4. 染色體特異性端粒長度在人群中是保守的
綜上所述，研究團隊開發(fā)了一種簡單通用的端粒富集分析方法Telomere Profiling，并跨越了廣泛的年齡范圍，基于該方法發(fā)現(xiàn)了染色體特異性和單倍型特異性的端粒長度分布，其中一些端粒長度之間存在顯著差異，拓展了端粒長度的臨床意義。綜上，Telomere Profiling將幫助人們更深入地了解端粒生物學(xué)，并有望推動相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展，從而有望找到治療疾病的新方法。
研究團隊指出：“Telomere Profiling可使精確的端粒長度研究廣泛應(yīng)用于實驗室、臨床和藥物發(fā)現(xiàn)工作中。因此，在未來的研究中，應(yīng)該加強不同人群的檢測，以證實某些染色體末端是否始終是最短的還是最長的?！?/p>
原文鏈接：
K. Karimian et al., Human telomere length is chromosome end–specific and conserved across individuals. Science (2024).?https://www.science.org/doi/10.1126/science.ado0431
