堿基編輯（base editing，BE）作為前沿的基因組編輯技術(shù)，能夠在基因組水平上實現(xiàn)精確、高效的單堿基編輯。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因治療和細(xì)胞工廠構(gòu)建等領(lǐng)域。常用的DNA堿基編輯器主要是通過將可編程的DNA結(jié)合蛋白（如Cas9）與堿基脫氨酶融合實現(xiàn)的，包括胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）以及糖基化酶堿基編輯器（GBE）等，可以實現(xiàn)C-to-T、A-to-G以及C-to-G等種類的堿基編輯。然而，這些堿基編輯器是針對C和A堿基的直接編輯，且所包含的脫氨酶可能導(dǎo)致非Cas9依賴的DNA或RNA脫靶。?

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員畢昌昊帶領(lǐng)的合成生物技術(shù)研究團(tuán)隊，聯(lián)合研究員張學(xué)禮帶領(lǐng)的微生物代謝工程研究團(tuán)隊，開發(fā)了不依賴脫氨酶（deaminase-free，DAF）的堿基編輯器DAF-CBE和DAF-TBE，分別在大腸桿菌中實現(xiàn)C-to-A、T-to-A的堿基顛換，在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)C-to-G、T-to-G的堿基顛換編輯。?

該研究通過定向進(jìn)化改造了人源尿嘧啶糖基化酶（UNG）的兩個突變體UNG（N204D）和UNG （Y147A），獲得了兩種高活性的DNA糖基化酶，分別可以作用于胞嘧啶堿基的CDG4和胸腺嘧啶堿基的TDG3。進(jìn)而，研究將這兩種DNA糖基化酶與nCas9（Cas9、D10A）融合，構(gòu)建了CDG4-nCas9和TDG3-nCas9兩種堿基編輯器，用于在大腸桿菌中進(jìn)行C-to-A和T-to-A的編輯。實驗結(jié)果顯示，CDG4-nCas9和TDG3-nCas9在大腸桿菌中的編輯效率最高分別達(dá)到58.7％和54.3％。進(jìn)一步，研究針對Homo sapiens密碼子優(yōu)化版本的CDG4-nCas9和TDG3-nCas9，在HEK293T細(xì)胞中實現(xiàn)了C-to-G和T-to-G的顛換編輯，編輯效率分別達(dá)到38.8%和48.7%。這兩種編輯器的脫靶效果低于常用的胞嘧啶堿基編輯器（BE4max）和糖基化酶堿基編輯器（CGBEs）。因此，研究將這兩個編輯器命名為DAF-CBE和DAF-TBE。此外，通過進(jìn)一步的工程改造，該團(tuán)隊優(yōu)化了CDG和TDG的空間位置，得到了DAF-CBE2和DAF-TBE2的新版本。它們的編輯窗口從原來的間隔序列（protospacer sequence）5'端移動到中間區(qū)域，且C-to-G和T-to-G的編輯效率分別提高了3.5倍和1.2倍。DAF-CBE和DAF-TBE實現(xiàn)了人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（hiPSC）高效編輯。?

綜上所述，經(jīng)過定向進(jìn)化改造，該團(tuán)隊開發(fā)的DAF-CBEs和DAF-TBEs堿基編輯器在大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了高效的堿基顛換編輯，無需使用脫氨酶。與現(xiàn)有的引導(dǎo)編輯器（prime editing）或糖基化酶堿基編輯器（GBEs）相比，DAF-BEs具有相當(dāng)?shù)木庉嬓?、更小的尺寸和更低的脫靶率，這擴(kuò)展了堿基編輯器的編輯類型，為工業(yè)菌株鑄造和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的相關(guān)研究提供了新的技術(shù)工具。?

近日，相關(guān)研究成果發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）上。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動專項、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會和天津市自然科學(xué)基金的支持。

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DAF-BEs堿基編輯器的設(shè)計及進(jìn)化